Η κήρυξη του πολέμου βρήκε τον Κωνσταντίνο Μητσοτάκη στην σχολή εφέδρων αξιωματικών Σύρου, απ' όπου και τοποθετήθηκε στη Μακεδονία, στο μετέπειτα γερμανικό μέτωπο. Μετά την κατάρρευση του μετώπου κατέβηκε στην Αθήνα και από εκεί μετέβη στην Κρήτη το 1942, όπου έλαβε μέρος στην αντίσταση κατά των Ναζί ως ηγετικό στέλεχος της Εθνικής Οργάνωσης Κρήτης (ΕΟΚ) και της Εθνικής Οργάνωσης Πληροφοριών και Δολιοφθοράς (ΕΟΠΔ) που αρχικά αποτέλεσε το στρατιωτικό σκέλος της Ανώτατης Επιτροπής Αγώνος Κρήτης (ΑΕΑΚ). Ο Κωνσταντίνος Μητσοτάκης συνεργάστηκε στενά με τις συμμαχικές ομάδες (κυρίως βρετανικές), οι οποίες δρούσαν στο νησί κατά των Γερμανών. Για τη δράση του αυτή, φυλακίστηκε και καταδικάστηκε σε θάνατο δύο φορές από τους Γερμανούς. Την πρώτη φορά πήρε χάρη με την ευκαιρία της εθνικής επετείου της 25 Μαρτίου 1944 και απελευθερώθηκε μαζί με άλλους εκατό περίπου συγκρατούμενούς του. Την 31 Μαρτίου 1945, αντηλλάγη για δεύτερη φορά, μαζί με 9 συντρόφους του, με τριπλάσιους γερμανούς αιχμαλώτους, λίγο πριν από την παράδοση των Γερμανών στα Χανιά. Η ανταλλαγή Ελλήνων πολιτών με Γερμανούς στρατιωτικούς, υπήρξε μοναδική στην ιστορία του Β' παγκοσμίου πολέμου και χρειάστηκε να εγκριθεί από την ανώτατη συμμαχική και γερμανική ηγεσία. Επίσης, στον Κωνσταντίνο Μητσοτάκη από την πλευρά των Ελλήνων και τον ταγματάρχη Denis Ciclitira από την πλευρά των Άγγλων, έγινε η μυστική παράδοση του τελευταίου Γερμανού Στρατηγού Benthag στο σπίτι του Ελευθερίου Βενιζέλου στα Χανιά, στις αρχές Μαΐου του 1945 προκειμένου να δρομολογηθεί η επίσημη παράδοση στο Ηράκλειο λίγους μήνες αργότερα.